SILENCIAMENTO DO GENE DA β-1,3-GLUCANASE DE Carica
papaya POR CRISPR-Cas9
Nome: MIRIELSON LOURES DA SILVA
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 18/03/2021
Orientador:
Nome |
Papel |
|---|---|
| PATRICIA MACHADO BUENO FERNANDES (M/D) | Orientador |
Banca:
| Nome |
Papel |
|---|---|
| JOSE AIRES VENTURA (M/D) | Examinador Interno |
| PATRICIA MACHADO BUENO FERNANDES (M/D) | Orientador |
| SILAS PESSINI RODRIGUES | Examinador Externo |
Resumo: A deposição de calose nos plasmodesmos está diretamente associada ao movimento
viral. A predição de micro RNAs de mamão infectados pelo complexo viral papaya
meleira virus (complexo PMeV) revelaram alta presença de miRNAs reprimindo a
expressão pós-transcricional de genes envolvidos na síntese de β-1,3-glucanases.
Nesse sentido, nosso trabalho teve como objetivo avaliar o silenciamento do gene da
enzima β-1,3-glucanase como forma de resistência ao complexo PMeV causador da
meleira mamoeiro. Para tal, foi utilizada a nova tecnologia de edição gênica
CRISPR/Cas9. Para atestar o funcionamento da técnica CRISPR/Cas9 em tecidos de
mamão, buscamos desenvolver um marcador visual interrompendo a biossíntese de
clorofila através do silenciamento do gene da fitoeno desaturase em folhas, células e
protoplasto de mamoeiro. Para a transformação de tecidos de mamão por
agroinfiltração, utilizou-se o vetor binário pKSE401 que possui o gene da enzima Cas9
e uma sequência customizável referente à estrutura do RNA guia. Os novos
plasmídeos gerados foram inseridos por eletroporação em Agrobacterium
tumefaciens GV3101, que passou a ser denominada AtpKSPD e AtpKSBG para
silenciamento da fitoeno desaturase e β-1,3-glucanase, respectivamente. Como
resultado, todas as folhas de mamão que foram submetidas à agroinfiltração por
AtpKSPD apresentaram despigmentação devido à inativação do gene da fitoeno
desaturase e o mesmo foi observado em embriões regenerados a partir de células
transformadas. Os tecidos agroinfiltrados expressaram o gRNA customizado junto
com Cas9. O mesmo método foi utilizado para AtpKSBG. Os resultados moleculares
indicam que houve a mutação do gene alvo. Além disso, foi possível observar maior
deposição de calose em células transformadas com AtpKSBG. Os resultados obtidos
atestam que o uso da tecnologia CRISPR/Cas9 pode ser aplicada com sucesso em
Carica papaya. Ressaltamos que até o dado momento não existe um protocolo
estabelecido para edição de C. papaya pela tecnologia CRISPR, deste modo, nosso
trabalho é pioneiro na aplicação da técnica em mamoeiro, com destaque também para
o pioneirismo no silenciamento gênico da β-1,3-glucanase e da fitoeno desaturase
nesta cultura, sendo o segundo um promissor marcador visual de funcionamento da
técnica para C. papaya.
Palavras-chave: Melhoramento genético. Engenharia genética. Inativação gênica.
Agronegócio. Cisgenia.
