Avaliação da expressão relativa de SLC34A2/NaPi-IIb em linhagens celulares de NSCLC sob tratamento com estrogênio e moduladores das vias de PKC e PKA
Nome: MURILO FANCHIOTTI CERRI
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 27/07/2010
Orientador:
Nome |
Papel |
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| LETICIA BATISTA AZEVEDO RANGEL | Orientador |
Banca:
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Papel |
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| LETICIA BATISTA AZEVEDO RANGEL | Orientador |
Resumo: Avaliação da expressão relativa de SLC34A2/NaPi-IIb em linhagens celulares de NSCLC sob tratamento com estrogênio e moduladores das vias de PKC e PKA
Palavras-chave: Carcinoma de Pulmão, SLC34A2, NaPi-IIb, 17-Beta-Estradiol, PKC, PKA, Calfostina C.
O carcinoma de pulmão (CP) representa um grande desafio à saúde mundial, configurando-se como a principal causa mortis por câncer entre homens e mulheres. No Brasil, são estimados 27.630 novos casos de cânceres de pulmão, traquéia e brônquio no ano de 2010, sendo 500 casos (170 mulheres e 330 homens) esperados para o estado do Espírito Santo.
SLC34A2 é um membro da família de genes carreadores de soluto e codifica uma proteína membranar de multi-passagem, o cotransportador de fosfato do tipo IIb (NaPi-IIb). Tal transportador utiliza o gradiente eletroquímico de íons sódio para realizar co-transporte de sódio e fosfato e é expresso fisiologicamente em uma variedade de tipos celulares, dentre as quais as células pulmonares alveolares do tipo II. Quanto à importância de NaPi-IIb para o CP, já foi reportado que o gene SLC34A2 tem expressão reduzida em até dez vezes em amostras de câncer de pulmão quando comparada ao pulmão normal.
O estrogênio endógeno e o exógeno são reconhecidos fatores de risco ao CP em mulheres, e possivelmente desempenham um papel no desenvolvimento do CP, particularmente, adenocarcinomas. Adicionalmente, estudos recentes têm proposto uma relação entre a ação do estrogênio e a expressão de NaPi-IIb em células não-cancerosas. Sabendo-se ainda do papel central das isoenzimas de PKC na carcinogênese e aliado a estudos que demonstram que a administração de AMPc estimula a expressão de mRNA de NAPi-IIb em células alveolares tipo II de ratos adultos, propusemos a avaliação da correlação entre PKA (mediador de AMPc), PKC, estrogênio e os níveis de expressão de NaPi-IIb nas células de CP humanas.
Para tal estudo foram utilizadas as linhagens de CP A549 e H460. Para cada linhagem celular, foram testadas as ações de reagentes com ação ativadora ou inibitória sobre PKC ou PKA na expressão de NaPi-IIb. Para tanto, utilizou-se PMA, Calfostina C, dB AMPc e KT 5720. Em paralelo, para a linhagem A549 foi realizado tratamento com concentrações crescentes de 17-Beta-Estradiol, além do controle tratado apenas com o veículo.
As células foram lisadas diretamente nas placas de cultura com o reagente TRIZOL e em seguida o RNA foi extraído seguindo protocolo da empresa. O RNA extraído foi utilizado para síntese o DNA complementar (cDNA) empregando-se o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. A expressão gênica foi analisada pela técnica de qRT-PCR utilizando equipamento 7.300 Real Time PCR Systems e empregando SYBR Green PCR Master Mix como sistema de detecção. A quantificação relativa da expressão gênica foi realizada através do cálculo do delta-delta Ct utilizando dois genes housekeepings: GAPDH e Beta-Actina.
Em nossas análises, notamos que PKC e PKA não influenciaram a expressão de SLC34A2/NaPi-IIb nas linhagens de NSCLC avaliadas. Observou-se, contudo, um aumento considerável na expressão desse gene quando tratado com Calfostina C, provavelmente, por um mecanismo independente de seu papel clássico na inibição de PKC. Foi reportado que Calfostina C pode induzir apoptose em algumas linhagens celulares tumorais por mecanismos que ainda não foram completamente elucidados. Dessa forma, sugerimos um possível envolvimento de NaPi-IIb nessa via pró-apoptótica, que corrobora o fato de tumores do tipo NSCLC apresentarem expressão reduzida de NaPi-IIb quando comparados ao pulmão normal. Observamos ainda uma tendência de diminuição da expressão do gene SLC34A2 em resposta ao tratamento com 17-Beta-Estradiol. Foi descrito que a diminuição da expressão de NaPi-IIb está associada à transformação maligna no pulmão, e os dados coletados sugerem que a diminuição da expressão de NaPi-IIb pode estar associada à ação pró-carcinogênica do estrogênio no CP.
